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人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒實驗不容易,其中還有這么多學問!

發(fā)布時間: 2021-04-16  點擊次數(shù): 884次
   人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被人Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
  本試劑盒組成如下:
 

人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒

 

  實驗前,要先進行洗滌,本試劑盒洗滌方法如下:
  1.自動洗板機:每孔加入洗滌液350μl,注入與吸出間隔60秒。洗板5次。
  2.手工洗板:甩盡孔內液體,在潔凈的吸水紙上拍干,每孔加洗滌液350μl,浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體,在厚的吸水紙上拍干。洗板5次。
  人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,并盡量避免起泡。
  1.加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜,37℃孵育2小時。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
  2.棄去液體,甩干,每個孔中加入工作液100μl(在使用前15分鐘內配制),酶標板加上覆膜,37℃溫育1小時。
  3.棄去孔內液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,大約350μl/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。
  4.每孔加工作液(臨用前15分鐘內配制)100μl,加上覆膜,37℃溫育1小時。
  5.棄去孔內液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
  6.每孔加底物溶液100μl,酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(根據(jù)實際顯色的情況酌情縮短或延長,但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時,即可終止)。
  7.每孔加終止液50μl,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。
  8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀電源,預熱儀器,設置好檢測程序。
  9.實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。
  當然,要想實驗結果更加可靠,這些事項也是要引起注意的:
  1、濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
  2、如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔一孔的OD值),請先將樣本稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請后乘以稀釋倍數(shù)(×5×n)。
  3、各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其正確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內,如標本數(shù)目多,推薦使用排槍加樣。
  4、嚴格按照說明書的操縱進行,人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒試驗結果判定須以酶標儀讀數(shù)為準。

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